Redaktion og opdatering af indholdet på denstoredanske.dk er indstillet pr. 24. august 2017. Artikler og andet indhold er tilgængeligt i den form, der var gældende ved redaktionens afslutning.

  • Artiklens indhold er godkendt af redaktionen

DNA-sekventering

Oprindelige forfattere HNie og JKje Seneste forfatter Redaktionen

DNA-sekventering, metode til bestemmelse af DNA-sekvensen, dvs. rækkefølgen af de fire forskellige nukleotider, der udgør grundenheden i DNA-strengen. I 1977 publiceredes to løsninger på et gammelt problem - hvordan sekventeres DNA:

1) Enzymatisk sekventering, også kaldet Sanger sekventering eller dideoxymetoden, er udviklet af den britiske molekylærbiolog Fred Sanger. Metoden er mest velegnet til lange DNA-molekyler (større end 100 nukleotider).

2) Kemisk sekventering, også kaldet Maxam-Gilbert-sekventering, er udviklet af den amerikanske molekylærbiolog Walter Gilbert og hans medarbejder Allan Maxam. Metoden er mest velegnet til korte DNA-molekyler (10-100 nukleotider) og til en række specialformål. Opfinderne delte nobelprisen i kemi i 1980 for deres opdagelser. I dag benyttes næsten udelukkende varianter af den enzymatiske metode.

Annonce

Enzymatisk sekventering

Enzymatisk sekventering bygger på den naturlige DNA-kopieringsmekanisme, der foregår i cellen under DNA-replikationen. Vha. oprenset DNA-polymerase får man i et prøverør dannet kopier af en DNA-streng. Metoden kræver, at det DNA, der ønskes sekventeret, er enkeltstrenget (ssDNA). Hvis det er dobbeltstrenget, er det nødvendigt, at strengene på forhånd adskilles (denatureres) ved behandling med base eller ved opvarmning.

Da DNA-polymerase ikke kan starte syntesen af en ny DNA-streng, men udelukkende er i stand til at forlænge et eksisterende DNA-stykke, må der kemisk syntetiseres et kort stykke ssDNA på 15-20 nukleotider, en såkaldt sekvensprimer. Dennes sekvens er komplementær til et DNA-område, der ligger tæt op ad det DNA, der skal analyseres. DNA-fragmentet og sekvensprimeren blandes i et prøverør, og pga. komplementariteten vil det lange fragment og den korte primer binde sig til hinanden. Der tilsættes en blanding af de fire byggesten i DNA-syntesen (deoxynukleosidtrifosfaterne dATP, dGTP, dCTP og dTTP), som skal fungere som substrater for DNA-polymerasen. For at man senere kan analysere produkterne fra reaktionen, bliver en del af nukleotiderne forinden mærket med detekterbare komponenter, som normalt er radioaktive isotoper som fx 32P eller 35S, eller fluorescerende grupper.

Blandingen opdeles mellem fire prøverør, som hver tilsættes en lav koncentration af en af fire forskellige unaturlige kædestoppere (dideoxyribonukleosidtrifosfater: ddATP, ddGTP, ddCTP eller ddTTP), der også fungerer som substrat for DNA-polymerasen og indsættes i positioner komplementært til nukleotiderne i den modsatte streng. Når DNA-polymerase tilsættes, starter syntesen af nye DNA-strenge, men med mellemrum indsætter enzymet en kædestopper i det nydannede molekyle, og så kan syntesen af DNA-strengen ikke fortsætte. Da kædestopperne indsættes i tilfældige positioner, bliver resultatet en blanding af DNA-strenge af forskellig længde. Ved at vælge det rigtige forhold mellem de naturlige byggesten og kædestopperne kan man opnå, at sandsynligheden for, at en kædestopper indsættes, er så lav, at polymeriseringen ofte fortsætter mange hundrede nukleotider hen ad DNA-strengen. Resultatet bliver en blanding af syntetiserede DNA-strenge, der alle indeholder den oprindelige sekvensprimer i den ene ende og en for hvert prøverør specifik kædestopper i den anden ende. Længden af strengen vil være et mål for nukleotidpositionen i det sekventerede DNA.

Når polymeriseringsprocessen er færdig, adskilles DNA-fragmenterne efter størrelse vha. gelelektroforese, og de enkelte fragmenter visualiseres ved eksponering af en røntgenfilm. DNA-sekvensen kan direkte aflæses ved at undersøge rækkefølgen af bånd i det alternerende mønster på røntgenfilmen.

Større sekventeringsprojekter bygger næsten udelukkende på den enzymatiske metode. Vha. denne metode kan man under optimale betingelser opnå sekvensinformation for op til ca. 800-1000 nukleotider i ét forsøg. Siden begyndelsen af 1990'erne har man forsket intensivt i automatisering af sekventeringsprocessen for at muliggøre sekventering af hele genomer. Der er udviklet en række forbedringer af metoden, der alle bygger på det samme grundprincip. Fx er det muligt at bestemme alle fire nukleotider i én reaktionsblanding ved at koble fluorescerende grupper med forskellige farver til de fire forskellige kædestoppere. Ligeledes har polymerasekædereaktionen (PCR) gjort det muligt at sekventere DNA-molekyler direkte, hvilket overflødiggør tidskrævende kloningsprocedurer, og pyrosekventering kan ved større sekventeringsopgaver. Ved pyrosekventering kan man sekventere 100 mio. nukleotider på én maskine på nogle få timer.

Kemisk sekventering

Kemisk sekventering anvender kemiske stoffer til sekvensspecifik kløvning af et intakt DNA-molekyle. Metoden kræver, at DNA findes som lineære fragmenter, og at regionen, der ønskes undersøgt, er nær ved en af enderne af DNA-molekylet. Først mærkes den ene ende af DNA med en radioaktiv eller fluorescerende gruppe. Dernæst adskilles de to DNA-strenge, og de kløves specifikt ved A, G, C og T med nukleotidspecifikke kemikalier i hver sit prøverør. Ved korrekt dosering af kemikalierne kan man opnå, at hvert DNA i gennemsnit kun rammes én gang, og at resultatet derved bliver en blanding af DNA-molekyler med vidt forskellige længder.

På samme måde som ved den enzymatiske sekventeringsmetode adskilles produktet ved gelelektroforese og visualiseres ved eksponering af en røntgenfilm. Kun de strenge, der indeholder den markerede ende, vil være synlige, og sekvensen kan direkte aflæses. En stor fordel ved kemisk sekventering er, at DNA-sekvensen kan læses helt hen til enden af DNA-molekylet, og at der ikke er brug for en sekvensprimer, hvorfor den kemiske metode ofte foretrækkes ved sekvensanalyse af korte DNA-stykker, fx syntetiske oligonukleotider.

Genomsekventering

Den første totale sekvens af DNA fra en bakterievirus (5386 basepar) blev publiceret i 1977 af Fred Sanger. Siden er der udført sekvensbestemmelser på adskillige andre virus, fx de 192.000 basepar, som udgør DNA i koppevirus. I 1995 publicerede to amerikanske forskergrupper ledet af J. Craig Venter og Hamilton O. Smith den første komplette DNA-sekvens for en levende celle, nemlig de 1.830.137 basepar, som udgør arvemassen hos bakterien Haemophilus influenza.

Siden er de komplette genomer for de fleste patogene mikroorganismer blevet sekventeret. Det samme gælder genomerne for alle vigtige modelorganismer i biologien (fx E. coli, knopgær, rundorm, bananflue, planten gåsemad og mus). Sekventeringen af de ca. 3,2 mia. basepar, der findes i menneskets arvemasse, blev offentliggjort i 2001 (se human genom-projektet), og sekventeringen af det første individ (en af opdagerne af DNA-dobbelthelixen, James D. Watson) blev offentliggjort i 2007.

Genomsekvenser er i almindelighed offentligt tilgængelige og man kan fx følge med i udviklingen på hjemmesiderne for det europæiske (EBI, European Bioinformatics Institute) eller det amerikanske (NCBI, National Center for Biotechnology Information) bioinformatikinstituts hjemmesider. Hvis man ønsker en mere visuel tilgang til de enorme datamængder, kan man anvende såkaldte genome browsers, fx ENSEMBL (ENSEMBL) eller UCSC genome-browseren (UCSC).

Referér til denne tekst ved at skrive:
Henrik Nielsen, Jørgen Kjems: DNA-sekventering i Den Store Danske, Gyldendal. Hentet 20. august 2019 fra http://denstoredanske.dk/index.php?sideId=65622