Redaktion og opdatering af indholdet på denstoredanske.dk er indstillet pr. 24. august 2017. Artikler og andet indhold er tilgængeligt i den form, der var gældende ved redaktionens afslutning.

  • Artiklens indhold er godkendt af redaktionen

mikroskop

Oprindelig forfatter JTrJ Seneste forfatter Redaktionen

Mikroskop. Tv. strålegangen i et almindeligt lysmikroskop. Lysfeltblænden bestemmer diameteren af det belyste område i præparatet, mens aperturblænden bestemmer topvinklen (aperturen) i det kegleformede lysbundt, hvormed præparatet belyses af kondensoren. Objektivet danner et forstørret billede af præparatet, mellembilledet, der forstørres yderligere af linserne i okularet og fokuseres på øjets nethinde af øjets linse. I midten strålegangen gennem præparatet, som kun er nogle få mikrometer (μm) tykt og er anbragt mellem to glasplader, objektglasset og dækglasset, indlejret i et materiale med samme optiske brydningsindeks som glas. Strukturdetaljerne i præparatet bryder lyset mere, jo mindre de er. Th. et fluorescensmikroskop. I strålegangen er indsat et overfladebehandlet spejl, der spejler det meste af det blå lys, men lader mere langbølget lys passere, fx gult udsendt fra præparatet ved fluorescens. Et excitationsfilter tillader passage af de bølgelængder, som fremkalder den ønskede fluorescens, og et emissionsfilter tillader kun passage af de bølgelængder, der udsendes ved fluorescens, og standser derfor refleksioner fra præparatet.

Mikroskop. Tv. strålegangen i et almindeligt lysmikroskop. Lysfeltblænden bestemmer diameteren af det belyste område i præparatet, mens aperturblænden bestemmer topvinklen (aperturen) i det kegleformede lysbundt, hvormed præparatet belyses af kondensoren. Objektivet danner et forstørret billede af præparatet, mellembilledet, der forstørres yderligere af linserne i okularet og fokuseres på øjets nethinde af øjets linse. I midten strålegangen gennem præparatet, som kun er nogle få mikrometer (μm) tykt og er anbragt mellem to glasplader, objektglasset og dækglasset, indlejret i et materiale med samme optiske brydningsindeks som glas. Strukturdetaljerne i præparatet bryder lyset mere, jo mindre de er. Th. et fluorescensmikroskop. I strålegangen er indsat et overfladebehandlet spejl, der spejler det meste af det blå lys, men lader mere langbølget lys passere, fx gult udsendt fra præparatet ved fluorescens. Et excitationsfilter tillader passage af de bølgelængder, som fremkalder den ønskede fluorescens, og et emissionsfilter tillader kun passage af de bølgelængder, der udsendes ved fluorescens, og standser derfor refleksioner fra præparatet.

mikroskop, instrument, der frembringer et forstørret billede af små objekter. Billeddannelsen kan baseres på forskellige fysiske principper. I denne artikel omtales de optiske mikroskoper, hvor billedet dannes ved hjælp af lys (elektromagnetisk stråling) i bølgelængdeområdet fra ca. 100 nm (ultraviolet) til 1000 nm (infrarødt), hvoraf området 380-750 nm er umiddelbart synligt for det menneskelige øje. Se også elektronmikroskop og rastertunnelmikroskop.

Ordet mikroskop kommer af mikro- og græsk skopein 'se, undersøge'.

Konstruktion

I det almindelige såkaldt sammensatte lysmikroskop gennemlyses det objekt, man ønsker at studere, præparatet, vha. en kondensor, der koncentrerer lyset i et kegleformet bundt. Spektralsammensætningen bestemmes af lyskilden og eventuelle filtre. Det er vigtigt for billeddannelsen, at en del af lyset er kohærent, dvs. at bølger, der udsendes samtidig fra et punkt på lyskilden, svinger i samme fase. Dette opfyldes ved at anvende en lille højtemperatur-lyskilde, fx en halogenlampe.

Objektet skal være tyndt og gennemskinneligt. Biologisk materiale præpareres ofte som tynde snit, mindre end 10 μm tykke; mineraler o.l. slibes til ganske tynde plader, slibesnit. Objektet påvirker lyset på flere måder: ved diffraktion (brydning eller afbøjning), faseforskydninger, ændring af spektralsammensætningen og evt. polarisation, således at lyset efter passagen medbringer information om objektets struktur og visse materialeegenskaber.

Annonce

Mikroskop. Carl Zeiss' store forskningsmikroskop blev markedsført i 1898 og rummer alle de væsentlige nyskabelser, hvormed Ernst Abbe bidrog til mikroskopets udvikling, og hvormed den teoretiske grænse for lysmikroskopets opløsningsevne blev nået. Med spejlet nederst kastes lys fra en ydre lyskilde mod kondensatoren. De fire objektiver sidder i revolverfatning. Mikroskopet kan kippes til vandret, og vha. en kraftig lyskilde kan det dannede, stærkt forstørrede billede projiceres op på en skærm; billedet fokuseres med en udtræksanordning for okularet, ganske som i et almindeligt lysbilledapparat.

Mikroskop. Carl Zeiss' store forskningsmikroskop blev markedsført i 1898 og rummer alle de væsentlige nyskabelser, hvormed Ernst Abbe bidrog til mikroskopets udvikling, og hvormed den teoretiske grænse for lysmikroskopets opløsningsevne blev nået. Med spejlet nederst kastes lys fra en ydre lyskilde mod kondensatoren. De fire objektiver sidder i revolverfatning. Mikroskopet kan kippes til vandret, og vha. en kraftig lyskilde kan det dannede, stærkt forstørrede billede projiceres op på en skærm; billedet fokuseres med en udtræksanordning for okularet, ganske som i et almindeligt lysbilledapparat.

Ved efterbehandling af lyset i et linsesystem, objektivet, der virker som en stærk samlelinse, frembringes et forstørret billede af objektet, kaldet mellembilledet, som kan betragtes direkte med øjet gennem endnu et forstørrende linsesystem, okularet, eller optages med et kamera.

I et binokulært mikroskop deles lyset fra mellembilledet vha. et prismesystem ligeligt til to okularer, således at to ens billeder ses med hvert sit øje; dette er mindre anstrengende for synet. Et stereomikroskop eller en stereolup er sammensat af to monokulære mikroskoper, hvis akser konvergerer med en lille vinkel mod præparatet. Objektet ses derfor samtidig med de to øjne fra to lidt forskellige vinkler, hvorved billedet får rumlig dybde. Stereomikroskoper konstrueres med stor arbejdsafstand (afstanden mellem objektiv og objekt). Opløsning og forstørrelse er moderate, ofte op til 60-100 gange, men tilstrækkelige som hjælp ved manuelt arbejde med små objekter, fx i mikrokirurgi, elektronik og finmekanik.

Objektivet er i de fleste mikroskoper anbragt over objektet, og kondensoren under. I et omvendt mikroskop betragtes objektet nedefra, hvilket er praktisk ved mikroskopi af objekter, der ligger i en væske i en lille skål, fx en cellekultur.

Grundlæggende for billeddannelsen er lysets diffraktion i objektet, der virker som et kompliceret optisk gitter, dvs. de enkelte strukturelementer afbøjer lyset mere, jo tættere de ligger. For at afbilde (opløse) to tætliggende strukturelementer som adskilte billedpunkter kræves, at såvel brudt som ubrudt lys fra hvert element vha. objektivet bringes til at mødes (fokuseres) i hvert sit punkt i billedplanet, hvor lyset interfererer, konstruktivt eller destruktivt, afhængigt af faseforskellen mellem de lysbølger, der mødes.

Objektivets opløsningsevne er således diffraktionsbegrænset, dvs. afhængig af dets evne til at indfange det lys, hvis udbredelsesretning er blevet ændret (brudt) af objektet. Denne evne udtrykkes ved objektivets numeriske apertur. Den teoretisk højeste opløsning, et lysmikroskop kan præstere med synligt lys, er knap 0,2 μm, og dette opnås ved brug af kortbølget (violet) lys, samtidig med at det snævre mellemrum mellem objekt og objektiv fyldes med en olie, der har nogenlunde samme høje brydningsindeks som glas (olieimmersion); derudover kræves, at præparatet er ganske tyndt, ca. 1 μm. De stærkeste, almindeligt anvendte objektiver forstørrer 100 gange, og mikroskopets samlede forstørrelse gives ved produktet af objektivets og okularets forstørrelser: på mange mikroskoper op til 1000 gange.

Mikroskop. 1 En levende celle, en fibroblast fra bindevæv, fotograferet med almindelig optik: Ingen detaljer er synlige. 2 En tilsvarende fibroblast fotograferet vha. fasekontrastoptik, der fremhæver forskelle i massetæthed og derved synliggør cellekernen og organeller i cytoplasma, ligesom de tynde udløbere, filopodier, der knap anes med almindelig optik, ses tydeligt. 3 Levende fibroblaster fotograferet med fluorescensmikroskop, efter at cellerne har indtaget det fluorescerende farvestof rhodamin 123, der selektivt optages i levende mitokondrier og udsender gult lys, når det belyses med blåt lys. Mitokondrierne ses som trådformede strukturer i cellernes cytoplasma.

Mikroskop. 1 En levende celle, en fibroblast fra bindevæv, fotograferet med almindelig optik: Ingen detaljer er synlige. 2 En tilsvarende fibroblast fotograferet vha. fasekontrastoptik, der fremhæver forskelle i massetæthed og derved synliggør cellekernen og organeller i cytoplasma, ligesom de tynde udløbere, filopodier, der knap anes med almindelig optik, ses tydeligt. 3 Levende fibroblaster fotograferet med fluorescensmikroskop, efter at cellerne har indtaget det fluorescerende farvestof rhodamin 123, der selektivt optages i levende mitokondrier og udsender gult lys, når det belyses med blåt lys. Mitokondrierne ses som trådformede strukturer i cellernes cytoplasma.

I ultravioletmikroskopet opnås en noget højere opløsning, ca. 0,1 μm, pga. lysets kortere bølgelængde, men linserne skal fremstilles af specielle glassorter, og billedet må registreres med et kamera, da ultraviolet lys ikke opfattes af øjet. Infrarødmikroskopet udnytter, at visse materialer, der er uigennemtrængelige for synligt lys, er gennemtrængelige for infrarødt lys, men oftest må billedet registreres med et kamera.

I mørkefeltmikroskopet er kondensoren konstrueret således, at præparatet belyses under en så flad vinkel, at det ubrudte lys passerer forbi objektivet, således at kun lys afbøjet af præparatet indfanges i objektivet. Strukturelementerne fremtræder herved som selvlysende objekter på en sort baggrund. Strukturer, der er mindre end objektivets opløsningsevne, kan således synliggøres, men de afbildes relativt større, end de er, og kan ikke opløses som adskilte strukturer, hvis de ligger tættere end objektivets opløsningsevne.

En farvet objektdetalje virker som et optisk filter, der kun tillader passage af lys af bestemte bølgelængder, og vil derfor billeddannes med disses farver. Dette udnyttes bl.a. ved undersøgelser af celler og væv, og hertil er udviklet et stort antal farvemetoder, der selektivt farver forskellige komponenter i præparatet, se histokemi og histologi.

Lys, der passerer en strukturdetalje, som har større brydningsindeks eller er tykkere end omgivelserne, bliver relativt forsinket. Denne forsinkelse andrager i biologiske præparater typisk ca. 1/4 bølgelængde. Dette forhold udnyttes i fasekontrastmikroskopet, hvori præparatet belyses gennem en ringformet blænde. I objektivets bageste brændplan, hvor det brudte og det ubrudte lys er rumligt adskilt, er indlagt en tilsvarende ringformet faseplade, som forsinker det ubrudte lys yderligere 1/4 bølgelængde i forhold til det brudte. Det brudte og det ubrudte lys er således ved mødet i billedplanet faseforskudt omkring 2/4 bølgelængde og interfererer derfor destruktivt, således at strukturen afbildes mørk på lys baggrund.

I differential interferenskontrastmikroskopet opnås en lignende virkning ved at lade lyset i kondensoren passere et særligt prisme, der deler en lysstråle i to ganske tætliggende, men adskilte og modsat polariserede stråler. I objektivet er indsat et tilsvarende prisme, der genforener de to stråler. Hvis disse på deres vej gennem objektet har passeret på hver side af en grænseflade mellem strukturelementer med forskelligt brydningsindeks og derfor er blevet indbyrdes faseforskudt, vil de ved genforeningen enten svække eller forstærke hinanden ved interferens. Fasekontrast- og interferenskontrastmikroskoper finder stor anvendelse i biologien, fordi de tillader direkte studier af levende celler.

I fluorescensmikroskopet, der ligeledes finder udstrakt anvendelse i biologiske studier, udnyttes den egenskab ved en række farvestoffer, at de fluorescerer, dvs. at de ved belysning (excitation) med lys af en bestemt bølgelængde udsender (emitterer) lys med en anden (altid længere) bølgelængde, der er præcist defineret af farvestoffet. I moderne fluorescensmikroskoper belyses det farvede præparat gennem objektivet vha. et skråtstillet spejl, der har den egenskab, at det reflekterer det kortbølgede, exciterende lys, som kastes ind fra siden, men lader det lys passere, der ved fluorescens emitteres fra præparatet, mens det exciterende lys reflekteret fra præparatet spejles ud af strålegangen. Ved fluorescensmikroskopi fremtræder objektet som selvlysende. Det er derfor muligt, ligesom i mørkefeltmikroskopet, at synliggøre strukturer, hvis størrelse er langt under mikroskopets opløsningsevne.

I polarisationsmikroskopet undersøges vha. en polarisator anbragt under kondensoren og en anden polarisator (analysatoren) anbragt under okularet, om strukturer i objektet har egenskaber, der påvirker lysets polarisationsretning. Polarisationsmikroskopet finder især anvendelse i mineralogi og ved tekniske materialeundersøgelser.

I det konfokale laserscanningmikroskop (CLSM) udnyttes det forhold, at lys fra en punktformet lyskilde af objektivet kan fokuseres i et præcist defineret plan i præparatet, og at lys udsendt herfra ved fluorescens eller refleksion med objektivet og en hjælpelinse kan fokuseres i et tilsvarende præcist defineret såkaldt konfokalt plan, mens lys udsendt fra andre niveauer i præparatet fokuseres i andre planer. En ganske snæver blænde anbragt i det konfokale plan tillader derfor kun passage af lys fra et bestemt niveau i præparatet. Ved at bevæge lyskilden systematisk (dvs. scanne) fås en tilsvarende scanning af præparatets punktbelysning. Lys fra et punkt i det definerede plan i præparatet registreres af en detektor og afbildes som et billedelement (en pixel) på en digitalskærm. Ved anvendelse af specielle spejle og filtre kan lys udsendt samtidig fra forskellige fluorescensfarver i det samme præparat adskilles og registreres i hver sin detektor og afbildes simultant i digitalbilledet. Ved systematisk at ændre præparatets afstand fra objektivet kan der optages en serie billeder, der hver repræsenterer et optisk snitplan i præparatet. CLSM har fået en vigtig plads i biologien, dels fordi det tillader simultan billeddannelse af forskellige strukturer, der er selektivt mærkede med forskellige fluorescensfarver, dels fordi det muliggør afbildning med høj opløsning i optiske snit af tykkere præparater, fx hele celler.

Historie

Opfindelsen af det sammensatte lysmikroskop dateres til omkring 1590 og tilskrives den hollandske brillemager Hans Janssen og hans søn Zacharias. Det bestod af to samlelinser indfattet i forskydelige rør. Forstørrelsen var beskeden, knap ti gange. Lignende mikroskoper blev omkring 1610 bygget og beskrevet af Galilei.

Anvendelsen af en enkelt samlelinse som forstørrelsesglas havde længe været kendt og blev perfektioneret i de såkaldt simple mikroskoper, der i en lang periode var de sammensatte mikroskoper overlegne mht. opløsningsevne (se fx A. van Leeuwenhoek). Det sammensatte mikroskop blev i 1600- og 1700-t. forbedret, navnlig ved ændringer af okularets konstruktion (bl.a. af C. Huygens), belysningen af præparatet samt den mekaniske konstruktion til fokusering og fastholdelse af objektet.

Opløsningsevnen var imidlertid længe stærkt begrænset af linsefejl (især kromatisk og sfærisk aberration). Et stort gennembrud skete omkring 1800 ved konstruktionen af akromatiske objektiver sammensat af linser af forskellige glassorter, der tilsammen delvis ophæver den kromatiske aberration.

Konstruktionen af sammensatte linser, bl.a. til mikroskoper, hvilede til efter midten af 1800-t. i høj grad på instrumentmagernes empiriske viden. En central person i den videre udvikling af lysmikroskopet blev E. Abbe, der i 1866 blev ansat hos Carl Zeiss i Jena. Omkring 1873 opstillede han en komplet teori for billeddannelsen i lysmikroskopet, hvilket muliggjorde rationel optimering gennem beregninger. I samarbejde med glaskemikeren Otto Schott (1851-1935) udviklede han de glassorter, der i 1886 muliggjorde konstruktionen af såkaldt apokromatiske objektiver og kompensationsokularer, hvormed linsefejlene elimineredes, og den teoretiske grænse for mikroskopets opløsning (0,2 μm) blev nået.

Fasekontrastmikroskopet, der var banebrydende for den biologiske forskning, blev opfundet i 1934 af F. Zernike, som udviklede fasekontrastprincippet. Han blev i 1953 belønnet med nobelprisen i fysik for denne opfindelse.

Referér til denne tekst ved at skrive:
Jørgen Tranum-Jensen: mikroskop i Den Store Danske, Gyldendal. Hentet 17. juli 2019 fra http://denstoredanske.dk/index.php?sideId=125457